Après la conquête de Constantinople par les Croisés en 1204, à l’instigation de la République de Venise, et l’affaiblissement conséquent de l’Empire byzantin, les Vénitiens et les Génois se disputèrent la suprématie sur l’île de Kos, alors nommée Lango. Les Génois parvinrent pendant un certain temps à ajouter Lango aux autres grandes îles (Metelino et Scio) qu’ils possédaient déjà près de la côte de l’Asie mineure. Les Vénitiens firent la conquête de l’île de Kos, mais, en 1314, le corsaire génois Vignolo de Vignoli, seigneur de l’île, fit appel aux Chevaliers de Saint-Jean. Après une courte occupation, les Vénitiens vendirent l’île de Lango à l’Ordre des Chevaliers Hospitaliers de Saint-Jean, également nommés Chevaliers de Rhodes où le siège de l’Ordre était établi depuis 1306.
Jusqu’à 1336, la situation resta litigieuse et il est possible que l’île ait été reprise par les Vénitiens, ou même qu’elle soit temporairement retournée à l’Empire byzantin. À partir de 1337, les Chevaliers de Saint-Jean tinrent fermement l’île de Kos : l’Ordre de Saint-Jean avait sur l’île ses propres gouverneurs qui étaient nommés par le Conseil des Chevaliers de Rhodes : ils contrôlaient étroitement l’île et ses habitants.
Le XIVe siècle vit les premières attaques par les Turcs ; les Hospitaliers réussirent à repousser ces attaques en 1457 et en 1477, principalement en raison de la puissance des fortifications qu’ils avaient édifiées sur l’île. Il s’agit notamment du château de Neratzia à l’entrée du port de la ville de Kos, du château d’Antimácheia au centre de l’île, qui fut attaqué sans succès en 1457, du château de Palaio Pyli et du château de Kefalos. Aujourd’hui encore, les réparations des dégâts infligés par les attaques turques sur les deux châteaux les plus importants, celui de Neratzia et celui d’Antimahia, sont clairement visibles.
L’île de Kos ne fut pas prise par les Ottomans, mais l’Ordre de Saint-Jean dût la leur être céder en 1523 après la chute de Rhodes. Les Chevaliers avaient gouverné l’île pendant environ deux siècles.